高攀龙，字存之，无锡人。少年时读书，就喜好程颐、朱熹的学说。万历十七年(1589)中进士，授行人职。四川佥事张世则进呈他的著作《大学初义》，诋毁程颐、朱熹的章句，并请求颁行天下，高攀龙上疏极力反驳他的错误，张世则这本书便没有颁行。
侍郎赵用贤、都御史李世达被别人攻击丢了官，袁中的议论多数归咎于大学士王锡爵。高攀龙上疏说：
“近来朝廷之上，正人君子被排挤一空。大臣则孙钅龙、李世达、赵用贤走了，小臣则赵南星、陈泰来、顾允成、薛敷教、张纳陛、于孔兼、贾岩被斥退了。近来李祯、曾乾亨又无法安心本职而乞求走了，选郎孟化鲤又借口推荐言官张栋，随着这股潮流去了。
“天地之间造就一个人才是很难的，国家需要人才是很急迫的，这样的废置排斥，以后的人才怎么接得上。这些情况已使得正直的人扼腕叹息，奸邪的人弹冠相庆，世道人心如此真叫人不胜感慨！而且现在陛下的朝讲已经停止很久了，朝臣不能望见皇帝的龙颜。皇帝传旨下来，虽然说是圣上亲自裁定，但这里面隐藏了些什么，难以揣度其究竟，所以朝廷内外的舆论，不是说‘辅臣想除掉不归附自己的人’，就是说‘近侍不利用正直的人’。陛下深居九重之内，也曾经把每位大臣是否贤能的情况写了陈列在左右；而陛下对于各臣，也曾想过他们为什么会获罪的原因吗？如果以为都是由于圣上发怒，可是各臣除孟化鲤之外，未曾听说有触犯圣旨的，为什么都遭罢免斥退呢？即便违抗了皇帝讲了不中听的话，例如董基等，陛下已经录用，为什么对于这些人却不是这样呢？我恐怕陛下有驱逐奸邪的果断，而左右的人反而利用来实现自己嫉妒的私心；陛下有接纳进言的博大胸怀，而臣子反而留给您拒绝谏诤的讥嘲。传到各地，写进史册，使圣德受累不浅。
“辅臣王锡爵等，看他自我约束的情况，好像胜过张居正、申时行；观察他的用心和五十步笑百步又有什么不同呢？即如各臣被罢退斥逐，如果以为当然是这样，那么是非邪正，一般人都能辨别，怎么忍心坐视皇帝的错误做法，难道不是为了发泄私愤，而得益于把那些人全都罢免斥退光吗？”
最后极力诋毁郑材、杨应宿说人坏话、巴结奉承应该罢免。杨应宿也上疏攻击高攀龙，所讲的话非常荒诞，没有根据。两份奏疏一起交给部院，议论的结果是请求对二人稍加责罚，以表示惩治过去，警戒未来。皇帝不准，降杨应宿二级，把高攀龙贬职流放到揭阳为添注典史。
御史吴弘济等议论挽救，都受到谴责。高攀龙上任七个月就因事归去，接着父母去世，于是不再做官，在家住了近三十年。言者多次推荐，皇帝都不醒悟。
熹宗即位，起用高攀龙为光禄寺丞。天启元年(1621)升为少卿。第二年四月上疏弹劾外戚郑养性，说：“张差梃击谋害太子实在是郑养性的父亲郑国泰所主使。现在人们议论纷纷，都怀疑郑养性勾结宫内外犯法作乱的人，另有异谋，怀疑积累多了得不到解决，应当考虑一个妥善处理的办法。至于刘保谋反，是中官卢受主使的，刘于简的供词都在。卢受本是郑氏的私党，而李如祯一家勾结郑氏，阴谋陷害名将，导致失地丧师，刘于简原来的供词，说明李永芳约了李如祯做内应。像崔文升向来就是郑氏的心腹，知道先帝有虚症，故意给他服用泄药，这罪不能赦免。陛下仅仅将他斥责赶走，而崔文升还秘密住在京城。应该勒令郑养性回到家乡，尽快将李如祯、崔文升绳之以法，以昭彰国家大法。”奏疏送入，皇帝责怪高攀龙多事，但终于遣送郑养性回了老家。
孙慎行因为“红丸案”攻击前朝首辅方从哲，交给大臣们讨论。高攀龙引用《春秋》首恶性之诛为例，把“红丸案”的主要责任归咎于方从哲。给事中王志道为方从哲辩解，高攀龙写信切实责备他。不久改任太常寺少卿，上疏陈述努力学习的重要，接着说：“方从哲的罪行并非只有‘红丸’一件事，他最大的罪行在于勾结郑国泰。郑国泰父子有计划地谋害先帝的事不止一件，开始是张差的梃击，接着是郑贵妃进送美女，最后是崔文升的药，而方从哲实在是佑护他。尽力扶持帮助郑氏的党徒，尽力铲除不听从郑氏的人；一时人心惶惑，只知道郑氏，不知道东宫太子。这是盗贼一样的臣子，讨伐盗贼，就是陛下的孝。而有的人却说：‘为先帝隐讳才是孝。’这是扰乱天下的歪理。陛下顾念圣母就应该宣布李选侍的罪行，顾念皇考就应该加厚对李选侍的恩德，这样就仁至义尽了。而有的人却说：‘为圣母隐讳才是孝。’明明是圣谕，看作是假托；像杨涟那样忠心，却被诽谤为居功自傲。大臣怕被说是居功，宁愿以待罪之身躲在一边，当君父有急难的时候，却在那里袖身旁观，这也是导致天下大乱的歪理。被这样的说法所迷惑，真正的孝不知道是孝，把不孝也当作大孝；真正的忠不知道是忠，把不忠也当作大忠。忠孝都可以颠倒，什么事情不可以胡为呢？所以方从哲、郑养性不能不讨伐，为什么还让他们住在天子脚下？”当时在朝廷暗中支持方从哲的势力很大，他们摘取了高攀龙奏疏中“不孝”的话激怒皇帝，将要对他严加谴责。叶向高大力拯救，这才停发俸禄一年。邹元标受到攻击，高攀龙请求和他一同罢免，皇帝下诏挽留他。升为太仆卿，提升刑部右侍郎。
天启四年(1624)八月拜左都御史。杨涟等一群人攻击魏忠贤，双方已势不两立。等到叶向高离职，魏广微天天引导魏忠贤做坏事，而高攀龙是赵南星的门生，一同在重要部门。御史崔呈秀巡按淮、扬回来，高攀龙揭发他贪污受贿的邪恶行为，赵南星建议把他充军，崔呈秀处境困迫，急忙跑到魏忠贤那里，乞求做他的干儿子，于是捡了谢应祥的事，说高攀龙党附赵南星。皇帝下了道严厉的圣旨责问追究，高攀龙自己承担罪责走了。不久，南京御史游凤翔调出当知府，揭发高攀龙挟持私人势力排挤他。下诏恢复了游凤翔过去的官职，革了高攀龙的职。崔呈秀还不解恨，一定要杀他，把他的名字偷偷塞进李实弹劾周起元的奏疏中，派遣缇骑前往逮捕他。高攀龙早上拜谒宋代儒家学者杨龟山祠，有人把这公文告诉了他，高攀龙回去和二个门生一个弟弟在后园的池上喝酒，听说周顺昌已经被逮捕，笑说：“我视死如归，现在就要实现了。”进去和夫人说话，跟平时一样。出来，写了两张纸告诉二个孙儿说：“明天交给官府的校尉。”于是让他们出去，关好门。过了一会儿，大伙推门进去，看到一盏灯火光微弱，高攀龙已经整整齐齐地穿戴好衣帽自己溺死在池中了。拆开他所封的纸，是一个遗表，说：“我虽然被革职，从前曾是大臣，大臣受侮辱就是侮辱国家。谨向北面叩头，跟从屈原遗留下来的榜样。”又有告诉门生华久诚的信说：“我能够像这样从容不迫的死去，多少还是得力于我一生治学的结果。”当时他六十五岁。远近的人听到他的死讯，没有不为他哀伤的。
崔呈秀还不解恨，假传圣旨把高攀龙的儿子世儒交给司法部门审理，刑部判世儒不能防范他的父亲，流放服劳役。崇桢初年，追赠高攀龙为太子少保、兵部尚书，谥号忠宪，授予高世儒官职。
起初，海内学者全部都尊奉王守仁的学说，高攀龙心里很不以为然，他和顾宪成同在东林书院讲学，以静为主。品行纯良忠厚，完全是一个正直的人，被当时的学者所尊奉。海内士大夫，认识的和不认识的，都一致称颂高、顾二人。高攀龙被革职的时候，皇帝下诏拆毁了东林书院。庄烈帝即位，学者重新修复了它。