伍文定，字时泰，湖北松滋人。他的父亲伍..当过贵州参议。文定自己考中弘治十二年(1499)进士。他臂力过人，擅长骑马、射箭，议论事情慷慨激昂。当初做常州推官，办事精明、勤快，很会断案，被称为强干的小吏。魏国公徐亻甫与百姓争抢田地，文定把田判给了百姓。刘瑾得到徐亻甫送的重礼后，就制造大案，巡抚艾朴以下十四个人都被逮捕了。文定已经升调为成都同知，也被抓进京城的大牢中，结果被罢官为民。刘瑾败亡以后，他重新起用到嘉兴做官。
江西姚源的盗贼王浩八等流窜到浙江开化抢劫，都御史俞谏传令让文定与参将李隆、都指挥江洪、佥事储珊一起讨伐他，驻军华埠。而都指挥白弘与湖州知府黄衷另外在马金扎营。盗贼刘昌三攻破营寨，活捉了白弘，官军受到了很大打击。浩八攻打华埠，江洪、文定打败了他，追到孔埠。李隆、储珊也追到池淮，破坏了敌人的巢穴，接着又进攻淫田。江洪率奇兵深入敌区，中了盗贼的奸计，与指挥张琳等都被俘。文定等将因为殿后得以生还，盗贼也就此逃回江西去了。俞谏等把文定忠于职责、勇敢作战的事迹上报朝廷后，朝廷诏令主管部门对他加以奖励。后来他升任河南知府，设计擒获了大盗张勇、李文简。因为才干优裕，能干大事，所以调往吉安。期间又定计平定了永丰和大茅山的盗贼。后来，又帮助巡抚王守仁平定了桶冈、横水。
宸濠叛乱发生后，吉安的百姓、士绅们争先恐后地逃跑或躲藏。文定把逃亡的斩了一个，群众才安静下来。然后他把守仁迎入城中。知府刑王旬、徐琏、戴德孺等先后到来，一起讨伐宸濠，由文定当大将。在二十五日那天的战斗中，文定亲身冒着箭头和滚石的威胁向前，大火烧着胡须也不退后一步。宸濠之乱被平定，他战功最大，被提升为江西按察使。张忠、许泰到南昌，想顶他的战功，而守仁已经拿获宸濠带到浙江去了。张忠等失望后非常恼恨。文定出来拜见，就把他给绑了。文定骂道“：我不顾诛杀九族为国家平定反贼，有什么罪？你们是天子的心腹，侮辱国家的忠臣义士，为反贼报仇，依法该斩了你们。”张忠更加恼火了，就把文定棰倒在地上。文定后来上书皇帝请求解职，武宗没有回答他。
不久他升任广东右布政使。尚未赴任，世宗皇帝即位。他上书检举张忠等人的罪状，并且说：“过去张忠、许泰与刘晖到江西来，张忠自称是天子的弟弟，刘晖自称天子的儿子，许泰自称威武副将军，与天子是同僚。他们侮辱朝廷命官，诬害善良百姓，提出千万般要求，侵夺了百万余资财，致使江西到处是饿死的尸首，盗贼汹汹而起。现在即使一刀刀割了他们三个，也不足以向江西百姓谢罪。现今首恶江彬、钱宁都已经法办了，这三个人实际上是他们的党羽。请赶快杀了他们，用以显示法律的威严！”又请求把没收宸濠的资产，发还给江西，作为建设江西的费用；慎重地清理冤案，释放张忠、许泰所陷害的无罪者，及宁王家族中没参加阴谋反叛的人员。世宗一并采纳了他的建议。
评定功绩，文定升为右副都御史，负责督办操江事务。嘉靖三年(1524)讨伐海盗，拿获了董效等二百多人，世宗颁发敕令奖励了他。不久因病请回家疗养去了。六年应召入京，做了兵部右侍郎，冬天升为右都御史，代胡世宁主持都察院的事务。
云南的少数族人首领安铨造反，打败了参政黄昭道，攻占了寻甸、嵩明。第二年，武定的民族首领凤朝文也起来造反，杀害了同知以下的官吏，与安铨联合起来包围云南。世宗诏令加封文定为兵部尚书兼前职，让他统辖云南、四川、贵州、湖广的军队讨伐叛乱者，让侍郎梁材督理军饷。正好芒部叛乱酋长沙保的儿子普奴也兴兵作乱，朝廷一并交由文定来镇压。文定没到云南，安铨等已经被巡抚欧阳重打败，于是文定调头去征伐普奴。左都御史李承勋极力说四川、贵州破缺不堪，不应当再动兵，于是召文定回京提督京营。文定到湖广，上书请假回家祭祖。过后，四川巡按御史戴金又上书说“：叛贼作乱开始的时候，大势头还可以招安。可是文定打定主意要进军，完全不珍惜机会。大车大马运输粮草，白白浪费了几十万石。等朝廷诏书命令作罢时，他还不肯停下来。又尽力述说土酋阿济等的罪过，使得当地军民纷纷传言，差一点又出个乱子。我认为文定应当治罪。”尚书方献夫、李承勋借此诋毁文定好大喜功，劳民伤财，于是命令他退休了。
文定以忠臣义士自相期许，遇到事情，敢想敢干，不与时俯仰，见风使舵。芒部叛乱一事，他恨那些小丑们几次造反，反复无定，所以想为国家弘扬威武，却被议事的大臣们从旁给阻挠了。当时朝廷一心要姑息偷安，因此他没能成就这桩功业。九年(1530)七月他死在家中。天启初，才被追谥为“忠襄”。