一五八三年十一月，佛朗西斯·瑟洛摩顿在伦敦家中就逮，在他家中搜出各种“罪大恶极的宣传手册”、天主教鬼子名单，以及他国船舰能顺利入侵的港湾记录。更令人感到不祥的是，门多萨大使显然涉入这些阴谋极深，这让沃尔辛厄姆爵士感到相当诧异，因为他怀疑的对象主要聚焦在法国大使身上，但若法国大使早知这些阴谋，可能早就避开以免受牵连。
尽管在伦敦塔中遭到刑求，瑟洛摩顿仍不愿吐露实情，但在女王下令二度施行肢刑后，他的勇气尽失。“现在我被迫吐露她的秘密，这对我来说是世界上最珍贵的东西。”他悲叹道。他透露这些阴谋背后主要的目的就是菲利普国王“对英国的企图”，其主要目的就是让玛丽·斯图亚特成为英国女王。罗马教皇、吉斯家族与耶稣会都涉入此案，计划分四波攻击进行，主要战场为苏格兰、爱尔兰、萨赛克斯与诺福克，而参与起义的则为英国与欧洲各地的天主教徒。计划进行得相当完整，只剩在英国发起叛乱行动。玛丽·斯图亚特与门多萨大使，都全力参与计划每个阶段的执行，但沃尔辛厄姆爵士在监视玛丽·斯图亚特的通信中，早已猜到玛丽·斯图亚特在搞鬼，因为她在多封信件中都漏了口风。
“相关事证显示，她想要骗我们放松戒心，”伊丽莎白女王做出此结论，“这样我们就不会发现他们在英国境内与欧洲各国的阴谋诡计。”
英国政府认定这是一个相当危险的谋反行动，因此主动出击，捉拿瑟洛摩顿名单中的几位天主教贵族。有些人被关进伦敦塔，有些人听到风声已经逃窜海外。这回因为有足够的证据定罪，因此宫廷人士坚决要求女王将玛丽·斯图亚特绳之以法，但却遭到女王断然拒绝。但她同意在泰伯恩行刑场处决瑟洛摩顿，并将门多萨大使驱逐出英国。门多萨大使临别前的最后一击，表示他的主公将会以战争报复这样的屈辱。但一直到伊丽莎白女王卸任前，西班牙都未再派遣任何一位大使前来英国。
英国国会与枢密院都想采取军事行动，欲以强烈的行动来保护女王，并呼吁女王尽快对玛丽·斯图亚特采取“最后”的手段。但女王依然犹豫不前，而这次莱斯特伯爵也站在她那一边，他提议将继续以尊荣高贵的方式囚禁玛丽·斯图亚特，这样的策略是为了英国的利益，若有一天玛丽·斯图亚特真的登上英国王位，她也会记得自己的命是谁给的。但在其他人都想要玛丽·斯图亚特的项上人头之际，这个意见显得相当孤单。
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一五八四年六月十日，安茹公爵因一场高烧在法国沙托特里逝世。安茹公爵之死意味着法国王位已经没有瓦洛王朝的血脉来继承，法王亨利三世膝下无子，法国王位只好传承给他的一位表亲，纳瓦拉的胡格诺教派领袖亨利·德·波旁（Henry of Bourbon）。
安茹公爵的死讯传来时，伊丽莎白女王显然陷入哀伤，整整三周，几乎天天都在公开场合中哭泣，让旁观者都明了，她对她的“小青蛙”感到相当不舍。英国宫廷也被迫为安茹公爵哀悼，伊丽莎白女王甚至身穿黑色服装悼念了长达六个月。“宫廷气氛一片忧伤，”沃尔辛厄姆爵士这样告诉一位朋友，“许多公开与私下的因素，让我们一整季神伤。”
伊丽莎白女王则写信慰问凯瑟琳·梅迪奇：
尽管您是安茹公爵的母亲，但我的哀伤并不逊于您。您还有其他孩子得以寄托，但我却毫无其他慰藉，此生无缘再见，只盼死后我能与他重逢。夫人，若您能看进我的心坎里，便能看见一个没有灵魂的躯壳，然而您有太多沉重负荷，我不想再以哀伤令您烦忧。
但并非所有人都认可她的诚意。当伊丽莎白女王向法国大使表示“我是个丧夫的寡妇”时，法国大使直指她是一个“非常懂得依照时势所趋调整自己的君主”。
此时传出了更糟糕的消息。奥兰治亲王威廉一世于七月十日在台夫特惨遭暗杀一事，震惊了欧洲各地的新教团体。这起暗杀事件背后的主谋，显然就是菲利普国王，此事对伊丽莎白女王来说代表着不祥，英国臣民们都相当担心她会是下一个受害者。现在，伊丽莎白女王与帕尔玛公爵的军队在尼德兰的对垒已经毫无阻碍，因为气势衰退的法王亨利三世正忙着处理宫廷中的派系问题，避免派系斗争白热化，而安茹公爵又已不幸去世。帕尔玛公爵的军队逐渐获得优势，拿下了一个又一个城池；伊丽莎白女王则认为，只要西班牙成功征服尼德兰，到时若找不出任何领袖来接替奥兰治亲王威廉一世的位子，菲利普国王接着就会放眼英国。因此，打压苏格兰女王不轨的举动有其迫切性。
玛丽·斯图亚特现已四十二岁，十六年的禁锢生涯，早已侵蚀了她原有的美丽与健康情形。她的头发变得灰白，体态臃肿，同时为风湿病与身体的慢性疼痛所扰。尽管英国政府多次同意让她前往巴克斯顿做矿泉治疗，但她的状况却一点也没有改善。
一五八四年，玛丽·斯图亚特主要居住在谢菲尔德城堡，在士鲁斯柏立侯爵的看守下生活。但偶尔当谢菲尔德城堡要进行清洁工作时，她就会住在士鲁斯柏立侯爵的其他住所。士鲁斯柏立侯爵负责审查她所有的通信内容，每当她在许可的状态下出外透透气，侯爵都会派遣一整队的守卫陪伴着她。事实上，无论城堡内外，玛丽·斯图亚特的身边都是守卫，到了夜间，甚至连附近的城镇与乡村都有守夜人。任何想要进入城堡外围地区的人，都必须回答自己来访的目的；若没有得到枢密院书面批准，任何人都不得进入城堡，也不得与玛丽·斯图亚特交谈。若她要接见访客，也都有人随时在一旁监视。
玛丽·斯图亚特非常痛恨这些限制，但她仍保有女王般的尊荣。她的家眷约有四十八人，此外还能挑选仆人，并给付仆人薪资、她的饮食与燃料所需的费用，尽管每年将近一千英镑，但伊丽莎白女王全都买单，她甚至可以在君主专用的顶篷下用餐，每次用餐时都能享用正式的两道菜餐点，而每道菜都有十六种选择之多。她也得以享受打猎的乐趣，但她的风湿病常常让她无法尽情享乐；因此她便与侍女们一同作精致刺绣手工，或是逗弄她身边许多赏玩用的小狗与鸟儿。她曾向友人表示，这一生除非成为英国女王，否则她可能都无缘踏出这囚锢她的大牢，因此尽管风险极高，她仍一而再再而三地想要达到目的，无视于严格监督着她的所有眼光。几年过去了，她与英国境外友人的通信越来越困难，这时的她只能仰赖愿意帮她突破沃尔辛厄姆爵士铺天盖地严密检查的家仆。
一五八四年八月，沃尔辛厄姆爵士决定加强玛丽·斯图亚特身边的安全检查；士鲁斯柏立侯爵承担看守玛丽·斯图亚特的重大责任多年，开始倾向对她仁慈宽大，现在，看守玛丽·斯图亚特的工作偶尔也会由拉尔夫·赛德勒爵士（Sir Ralph Sadler）进行。隔月，沃尔辛厄姆爵士出示一封信给伊丽莎白女王看，证明她的表侄女依然密谋要推翻她，玛丽·斯图亚特因而从谢菲尔德移监前往斯塔福德郡的温菲德，到了一五八五年一月，再度被关进那令人望之生畏的特伯利城堡。在那里要出外打猎的可能性变小了，她要请人挟带信件也更加困难。尽管她对此大加抗议，并抱怨特伯利城堡又湿又冷，但她依然能维持生活水平，且历史证据也显示，英国政府提供了相当充足的饮食与燃料。当然也有人直截了当地告诉她，因为苏格兰的生活水平远低于英格兰，因此“当她身在自己的国家时，绝不可能接受如此高规格的款待”。
但这一切也无法确保伊丽莎白女王的安全。一五八四年秋天，忧虑的声浪让英国境内的士绅贵族全都动员起来，采取更严格的预防措施以对抗英国王权受到的威胁。一名耶稣会神父克雷顿遭到荷兰政府逮捕，他身上带着一份文件，详细记载了菲利普国王那恶名昭彰的“对英国的企图”，让英方的敏感神经与愤慨顿时爆发。
莱斯特伯爵提议组成一支新教卫士联盟，这些人必须宣誓必要时愿意以女王之名抛头颅洒热血；若苏格兰女王涉及谋反欲取伊丽莎白女王的性命时，就算是偷偷摸摸的地下运作，都必须摧毁掉她。此举得到枢密院许多参事支持，传言女王可能也相当支持，只是她随后否认。这个誓言被称为联盟誓约。这一年十月，当英国政府将这个行动公之于世时，完全击中了社会大众的忧虑，在全国各地得到上千名卫士的热烈回响，他们纷纷加入卫士联盟并大胆宣誓。他们完全不在乎是否会冒犯到信仰天主教的邻人，大声宣告宁愿面对内战也不愿接受天主教鬼子当他们的君主。在伯利男爵的教唆下，有人将联盟誓约让玛丽·斯图亚特过目，以此举清楚地向她表明，若她继续挑衅，她的性命可能会受到重大危机。
玛丽·斯图亚特在罪证确凿的状态下，表示自己对推翻伊丽莎白女王的任何阴谋都不知情，甚至在联盟誓约上签下了自己的名字；两天内，她便着手撰写了一封信件给西班牙菲利普国王，要他尽快将“对英国的企图”付诸实践，就算要她赔上性命也无所谓。
伊丽莎白女王对自身安危相当不重视，甚至到了令人挂虑的地步，而宫中的男性参事们对她那犹豫不决的女性特质感到相当疼惜；他们为了捍卫她的利益，甘愿不惜牺牲性命。尽管臣民上下一心地对她展现忠诚与情感，让她感动不已，但她仍不愿轻易允许所谓的私刑制度，只表示她绝不会轻易地“为了某一个人的错”把另一人杀死，也不愿意允许任何可能影响臣民道德良知的法条。英国国会也有相同的看法，坚持在通过成为法律之前，联盟誓约必须先行修正。从今以后，任何密谋叛国的“不法之徒”，在“面对极刑”之前，都必须先经过审判。
为了避免新法上路后，玛丽·斯图亚特可能要面对审判的窘境，伊丽莎白女王再度尝试与詹姆士六世沟通，盼望他愿意与母亲权力共享。然而尽管苏格兰王詹姆士六世积极想要与英国结盟，但他仍清楚表明自己并不希望母亲回到苏格兰来制造麻烦。伊丽莎白女王这才发现，对于詹姆士六世的背叛，玛丽·斯图亚特被蒙在鼓里好几个月。
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十月份，一本名为《莱斯特国协》的册子，恶意地攻击了莱斯特伯爵，这本书四处流传散布，内容重复叙述着过去到现在，关于他的各种下流、破坏名誉的流言。册子里做出更严重的指控，直指他是个连续杀人魔、性好勒索敲诈，更是个不折不扣的罪犯。这本册子严重地扼杀了他的人格，而且撰写得相当出色，让许多人都相信了它的真实性。莱斯特伯爵向来不是受欢迎的人物，在这个事件当中，仅有的站出来为他说话的人，就是菲利普·西得尼爵士与伊丽莎白女王。伊丽莎白女王下令查禁这本手册，并宣称“只有恶魔”才会相信这些恶意的谎言，并写信给伦敦市长，大赞莱斯特伯爵“对国家的服务、对宗教的忠贞与其他可靠的行事风格”。
几乎可以确定《莱斯特国协》是耶稣会的杰作，在安特卫普或巴黎印制，但这本册子与过去其他的册子不一样的是，书中含有近乎真实的许多细节，也因此增加了它的可信度。许多人都认为，书中内容的真实性，就是它遭查禁的主因。这些杜撰的故事流传了将近三个世纪，这段时间，莱斯特伯爵一直受到多数史学家的诋毁，被形容成无耻的冒险家与弒妻凶手，一直到了近代，《莱斯特国协》中的瑕疵才被正式揭露，为莱斯特这个女王的忠仆平反。
因为他试图让儿子[1]与雅贝拉·史都华结婚，因此，莱斯特伯爵的敌人们也质疑，透过这个举动，他是否想要重蹈覆辙，制造与父亲护国公诺森伯兰公爵与珍·格雷小姐一样的阴谋。玛丽·斯图亚特认定，哈维克的贝丝小姐策划“孙女雅贝拉成为英国王位继承人”一事，简直是“徒劳无功”，同时写信要求法国大使，确保伊丽莎白女王了解这个情形。然而莱斯特伯爵却说服女王，他让两人成婚最主要的目的，只是巩固英国与雅贝拉的表哥詹姆士六世之间的关系。
此时，莱斯特伯爵与伊丽莎白女王之间的关系，已经达到新的境界，两人不再互相认定为爱侣，也不再交换书信诉情衷，而是以老朋友的姿态相称，长达四分之一个世纪的共同生活与情感，维系着两人。宗教也是两人的共通点之一，也是莱斯特伯爵写给女王的许多信件中的主题，包括这一封他于一五八三年写给女王的信：
衷心感谢陛下亲切的问候。您可怜的“眼睛”除了向神祈祷外，别无报答之法，盼神能永远保您平安、健康与喜乐。因为神的仁慈，亲爱的陛下，让您避开许多恶意的侵害。女王陛下维持并建立了神眼中真正的宗教，抵御各种人为的手段与诡计，因此我们看到神赐予您的恩典。愿神佑您有披荆斩棘、乘风破浪之势。
他们两人依然有时争吵，一次莱斯特伯爵告诉海登爵士自己不参加枢密院会，因为“这么多双眼睛都看到，从女王陛下口中公开吐出，是我毕生最大的耻辱”。就算经过这么多年，女王那些带刺的话还是能深深伤害他，但最后他总是会原谅并遗忘，不过，有时候伊丽莎白女王也会道歉。
一五八四年时，莱斯特伯爵带着他的继子，年仅十八岁的小艾赛克斯伯爵来到宫中，他那“讨人喜欢的个性、雅致的风格、与生俱来的殷勤礼貌，几乎随即为他赢得女王与所有人的心”。莱斯特伯爵因此感到十分满意，殷殷期盼小艾赛克斯伯爵能取代那讨人厌的莱礼爵士在女王心目中的地位，但伊丽莎白女王还需要一点时间，才能认清小艾赛克斯伯爵不只是个俊俏、有教养的小男孩而已。
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这一年的年终时，又爆出另一个与伊丽莎白女王作对的阴谋。一位威尔士国会议员威廉·派瑞（Dr.William Parry），秘密躲在女王在里奇蒙德宫的御花园中，企图在她散步透透气的时候刺杀她，但当女王现身时，他被女王庄严的气势震慑住，甚至看到她的父亲亨利八世的身影，尽管他已下定决心，但他的手就是不听使唤。
他谋杀女王背后的动机有各式各样的传闻：派瑞到过欧洲各地旅行，罗马教皇必定认为他是玛丽·斯图亚特的代表，也是她派驻在巴黎的探子；但派瑞其实也是英国的双面谍，秘密为伯利男爵效力，他从欧洲返国时便已事先通知伊丽莎白女王，他要演一出谋刺未遂的戏码，以利他打入天主教鬼子的圈子中。女王赐予赏金，接着派瑞询问一位合伙人，愿不愿意当那个谋刺女王的人，因此在演出谋刺未遂的戏码前，就因行为怪异而遭人侧目。他也许和前一年的约翰·索默维尔事件一样，精神错乱了，但在审判过程中，他仍能清楚地否认自己意图不轨。
他谋杀女王的意图引发反弹声浪，英国政府方面甚至不想给予其判决前无罪的人权。“想到可能失去这么珍贵的东西，我全身的关节都在颤抖。”一名国会议员记录下这样的心情。英国下议院呼吁女王让他们执行比死刑还可怕的刑罚，来惩罚这些叛国贼，还有更多人要求将玛丽·斯图亚特就地正法。伊丽莎白拒绝了这两种声音，但到了一五八五年二月，她总算同意判处派瑞绞刑。同时英国国会通过新的法令，要求神学院教士四十天内离开英格兰，否则就要面对通敌叛国罪名的惩罚，而沃尔辛厄姆爵士也开始着手征召更多密探。
尽管女王向国会表达感激之意，谢谢他们“维持我生命的安全，你们的忧虑对我意义深重”，但对于英国孤立的状态与更多意图刺杀她的举动，她依然不为所动。“他们想要夺我性命，”一位来自英国于一五八三年建立的殖民地纽芬兰的代表，曾听过女王如此表述，“但我没什么好害怕。主宰一切的神一直保护我到这一刻，也将会保我安康，我相信神的大能。”
她坚持不改变自己的生活方式，也不愿在臣子们的殷殷期盼下，受到维安加强的限制。她和过去一样，常常出现在民众的眼前。当她与臣子们到乡间漫步时，她也仅让卫士们“带着轻巧的武器”。她也不愿听从莱斯特伯爵的建议，禁止倾向天主教的人士进宫。这导致枢密院成员总是为她的安危感到焦虑，但同时对于她的勇气也相当佩服。
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三月份，詹姆士六世写信向母亲表明，若要他与“被困在沙漠中”的人联手，是绝对不可能的事情。面对儿子的背叛，玛丽·斯图亚特伤心欲绝，在了解到自己透过外交途径协商重获自由的希望破灭后，她也感到分外愤愤不平。
“唉！”在一封情感丰富的信件中，她向伊丽莎白女王哀诉着，“从未见过如此可恶的不孝子，身为独子，却剥夺母亲的王权与皇室地位？”她矢言抛弃詹姆士。“在这么多基督教国家中，我一定能找到一位有能力掌握我给予的一切的人。”为了避免表阿姨误以为自己在打英国王位的如意算盘，苏格兰女王赶紧补充说明，表示“她比任何人都厌恶这些可怕的作风与恐怖的行动”。但私底下的她已经决定将她对英国王位的继承权与野心转给西班牙的菲利普国王。
四月份，阿米爱斯·伯勒特爵士（Sir Amyas Paulet）被指派为玛丽·斯图亚特的管理人，总算得以更严格的监督管理来限制玛丽·斯图亚特的各种行为。伯勒特爵士此时将近五十岁，是一位恪遵规则的人，他以强烈的清教主义观点闻名遐迩。当玛丽·斯图亚特了解这个人的观点时，她相当激烈地大表反对，这不只是因为他“完全没有骑士的资格”，还因为他的容忍度比多数与她信仰同一个宗教的人都要低，阿米爱斯·伯勒特爵士在巴黎担任大使期间，对玛丽·斯图亚特派驻巴黎的探子都相当严酷。但伊丽莎白女王选择伯勒特爵士的原因，是他“对神相当虔敬，对我们十分忠心，可说是相当正直的人，自出生就非常高贵”。他的诚实与对君主毫不畏缩的忠诚，在担任泽西岛总督时便展露无遗，伊丽莎白女王可以完全信任与仰赖他，绝不会受到苏格兰女王的奸计或魅力所诱。事实证明，他是一个非常勤勉又严格的管理人，他的警觉一刻也不松懈，也从不擅离职守，对于玛丽·斯图亚特试图拉拢他的举动，维持一贯不为所动的态度。
上任后，伯勒特爵士刻不容缓地在玛丽·斯图亚特居住的环境中大行“严苛的改变”，玛丽·斯图亚特随即发现，在伯勒特爵士的管理之下，她的人生将过得更加辛苦，也将与整个世界隔绝。伯勒特爵士检查她的每一封信：什么也逃不过他的法眼，许多外国友人寄给她的信件，在沃尔辛厄姆爵士的桌上堆积成山。伯勒特爵士不允许访客拜访玛丽·斯图亚特，并在城堡四周加强维安。玛丽·斯图亚特的仆人们，都不准到城墙上走动，当玛丽·斯图亚特出外散步时，身旁总是陪着大批重装军人，不让任何当地民众接近她。而她也不准施舍救济品给路上的穷人，对此她认为这个规定相当没有教养。
伯勒特爵士的安全规范只有少数漏洞，玛丽·斯图亚特的洗衣妇就住在邻村，定期会来到城堡中，对于这位洗衣妇带来的危险，伯勒特爵士似乎束手无策。除非他每次都要求这些人脱衣检查，但对于他这么正直的人来说，根本不可能，他无法完全确定他们没有挟带玛丽·斯图亚特的口信出去。他能做的就是严密监视这些人。
一五八五年时，英国与西班牙之间的关系更加恶化。五月份时，菲利普国王为了报复英国攻击他的船只，下令没收停泊在西班牙港湾的所有英国船舰，成为他在里斯本的船队组成部分。尽管不愿意，但他已准备好与英国开战，他认为这是他的神圣使命。三个月后，伊丽莎白女王在无双宫与荷兰签订协约，荷兰成为英国唯一的盟邦。九月份时，她又指派德瑞克爵士为舰队司令，提供一支有二十二艘船与两千人的舰队给他，派他出航准备占领西班牙在加勒比海的许多一流海港。德瑞克爵士的任务非常成功：他在西班牙海岸占领了维戈港，接着前往东印度群岛，劫掠了圣多明各、古巴的哈瓦那及南美洲西班牙属地首都卡塔赫纳。