左光斗，字遗直，安徽桐城人。万历三十五年(1607)进士，授职中书舍人。选拔担任御史，巡视宫城。逮捕整治吏部凶狠霸道的官员，缴获假印七十多枚，假官一百多人，震动京师。
派出管理屯田，说：“北方人不知道水利，一年之后土地荒芜，二年之后农民搬家，三年之后土地人民都无利可言了。现在要想天干没有旱灾，长期下雨不遭水灾，只有兴修水利这一条路。”于是上书陈述“三因十四议”：因天时，因地利，因人情；议疏通河流，议开凿渠道，议建筑堤坝，议兴修水闸，议修筑陂塘，议勘探土地，议构筑水池，议招徕人民，议选择人才，议选择将领，议派兵屯田，议按地力确定等级，议将富裕的农民赐给官爵。办法是犁耕与放火烧荒同时并举。下诏都允许他们实行。农田水利大规模地兴修，北方人开始知道种植水稻。邹元标说：“三十年以前，京城的人民不知道稻草是什么东西，现在到处都是水稻，这是兴修农田水利的功劳。”宦官刘朝声称有东宫的旨义，索取外戚亲贵的废田，左光斗不拆封退回了，说：“国家的每一尺土地是殿下的，今天怎么敢私人接受。”宦官气忿地离开了。
光宗驾崩，李选侍占据乾清宫，逼迫皇太子封她为皇后。左光斗上书说：“内廷的乾清宫，好比是外廷的皇极殿，只有天子控制上天才能够居住，只有皇后作为天子的配偶才能一起居住在那里。其余的嫔妃虽然先后与皇帝同居过但不能长期居住，不仅是为了避嫌，而且是为了区别尊卑的秩序。李选侍既不是皇帝原配，又不是皇太子的亲生母亲，却堂而皇之地居住在正宫里面，而让殿下退出来居住慈庆宫，不能够举行国宴，实行国家大礼，在名份上怎么说得过去？李选侍服侍先皇帝没有脱去发簪请罪告诫皇上的美德，对于殿下没有照看养育的恩情，这样一个人，难道可以把皇帝托付给她吗？况且皇帝已经有十六岁了，内有忠诚正直、老成持重的大臣辅佐，外有公卿大臣的辅助，何必担心没有人，还要人喝奶，像个婴孩背在身上吗？况且皇帝新登基，正应该不被人牵制，何必一定要交给一个妇人之手呢？到现在还不早做决断，将来会被她借抚养的名义，实行专制统治，武则天的祸害今天再现，将来的人又怎么说。”当时李选侍想控制国家大权。廷臣上书奏议，让她先进乾清宫，然后进慈庆宫。看到左光斗的上书，李选侍非常愤怒，想严加谴责。多次派使者召见左光斗。左光斗说：“我是天子法定的官员，不是天子召见不去。你们这帮人是干什么的？”李选侍更加愤怒，邀请熹宗皇帝到乾清宫商议。熹宗不肯前往，派使臣拿来左光斗的上书，读它，认为他是好的。催促选择日期移宫，左光斗于是免除处罚。这个时候，宫廷的形势很微妙，人们的情绪也很紧张，左光斗和杨涟同心协力上疏建议，排斥太监，辅佐年轻的皇帝，明皇室正统得以巩固，二人出力最多。由此朝廷内外称之为“杨、左”。
不久，御史贾继春给内阁上书，说皇帝不应该轻视自己的庶母。左光斗听说，立即上奏说：“先皇帝驾崩，大臣将皇上从乾清宫迎接到慈庆宫，臣等认为不应该回避李选侍，所以我在初二这一天上了道《慎守典礼肃宫禁》疏。宫中感到震惊而愤怒，几乎遭祸。幸亏皇上保全，将我的上疏交给内阁讨论。初五，内阁大臣备文再一次催促，李选侍奉旨移宫。到了初六，皇上即位，回到乾清宫。皇宫禁中都很恭敬，朝廷内外一片安宁。皇上既然应该回到乾清宫，那么李选侍就应该搬往别处，这个道理是很明白清楚的。只是移宫之后，自然应该保全大体，摒弃小的恩怨。假如还不停地追究罪责，使得宫中不得安宁，就是有损于国家。乞求皇帝立即惩罚盗窃宝物的宫奴刘逊等人，对其余的人则一概不予追究。”皇帝于是宣告百官，一一陈述李选侍侮辱虐待皇帝母亲的种种情形，等到召见大臣时又说：“朕跟李选侍有仇。”贾继春因为这个原因被定罪离职。
这时朝臣们议论改纪年的事情。有人主张不用泰昌这个年号；有人主张取消万历四十八年，就以今年为泰昌元年；有人主张以明年为泰昌元年，而以后年为天启元年。左光斗力排众议，请求以今年八月为界，这之前为万历，这之后为泰昌，讨论才算结束。孙如游由宫中传旨进入内阁，没有经过外廷，他上疏极力驳斥。出任京城附近地区的学政，杜绝请客送礼的风气。
天启初年，廷议起用熊廷弼，处罚言官魏应嘉等人，左光斗独自一人上疏反对，说熊廷弼很有才干但气量狭小，过去用他驻守辽阳则有余，现在仍用他防守辽阳则不足。不久熊廷弼果然失败。天启三年(1623)秋天，上疏请求召回文震孟、满朝荐、毛士龙、徐大相等人，并乞求召回贾继春和范济世。范济世在议论“移宫”这事上与左光斗意见不合，皇帝没有采纳。这年提拔为大理丞，升任少卿。
第二年二月授职左佥都御史。这时，韩火广、赵南星、高攀龙、杨涟、郑三俊、李邦华、魏大中等人都占据要害部门，左光斗跟他们很要好，务求做到言辞激烈，评论深刻，鉴别士人才识品行等级，正直的人都依靠他们，而忌恨他们的人逐渐不能容忍。左光斗跟给事中阮大铖是同乡，招他进入北京。正好吏科都给事中空缺，能够胜任此职的，首推周士朴，其次是阮大铖，再次为魏大中。阮大铖巴结宦官，勒令周士朴不得升任，将吏科都给事中据为己有。赵南星讨厌他，想按惯例将阮大铖迁职，阮大铖怀疑左光斗从中捣鬼，很怀恨他。熊明遇、徐良彦都想当佥都御史，赵南星却引荐了左光斗，这二人也怀恨左光斗。江西人又因为其他原因怀恨魏大中，于是一起唆使给事中傅魁弹劾左光斗、魏大中跟汪文言狼狈为奸。左光斗上疏辩解，还揭发傅魁跟东厂理刑傅继教结拜为兄弟。傅魁又恨又怒，再次上疏攻击左光斗。左光斗请求罢官，事情才算完。
杨涟弹劾魏忠贤，左光斗参与谋划，又跟高攀龙共同揭发崔呈秀私藏赃物，魏忠贤和他的党徒都发怒了。等到魏忠贤赶走赵南星、高攀龙、魏大中，接下来就该轮到杨涟、左光斗。左光斗很气愤，草拟奏疏弹劾魏忠贤和魏广微三十二条死罪，准备在十二月二日上交，先派妻子儿女回到南方。魏忠贤刺探知道了，抢先二天利用推事将左光斗一起削籍为平民。小人们还不解恨，又制造汪文言案，列入左光斗的名字，派使者前往逮捕他，父老乡亲都拥在马首痛哭，声音在原野上回荡，皇帝的使臣也被感动得流下了眼泪。到京后，下诏打入监牢严刑拷问，许显纯诬陷他们接受杨镐、熊廷弼的贿赂。杨涟等人开始不承认，后来担心不承认会被拷打致死，希望把他们交给法司，能够延缓一下然后再做打算，各人都违心服罪。左光斗被定罪贪赃二万两。魏忠贤于是假传圣旨，仍然命令许显纯五天追问拷打一次，不交给法司，各人开始后悔失策。容城人孙奇逢是一位奇侠之人，跟定兴人鹿正认为左光斗对京城一带有功，倡议凑钱营救，大家争着响应。收集了几千两，商量交给内府，暂缓对他的处罚，而左光斗和杨涟已于同一天被狱卒打死了，这时是天启五年(1625)七月二十六日，终年五十一岁。
左光斗已经死了，赃款还没有还尽。魏忠贤命令抚按官严加追讨，牵连下狱的有十四人。长兄左光霁受牵连判罪致死，母亲过份悲伤也死了。都御史周应秩还认为有关部门不努力承办追查，上疏催促，因此他的家族都破产了。等到魏忠贤编修《三朝要典》，把杨涟、左光斗定为“移宫案”的首犯，议论打开棺材侮辱他们的尸体，有人说情，才得以幸免。魏忠贤死后，追赠左光斗右都御史，录用他的一个儿子。不久，又追赠太子少保。南明福王时，追加谥号忠毅。