赵南星，字梦白，高邑人。万历二年(1574)进士，授职汝宁推官。行为廉洁，治理太平，逐渐提升为户部主事。张居正卧病，朝廷大臣都为他祈祷，赵南星与顾宪成、姜士昌不去。张居正死，调任吏部考功郎中，称病回家。
起用担任文选员外郎。上疏陈述天下四大害，说：“杨巍乞求退休，左都御史吴时来图谋取代他，忌恨户部尚书宋纟熏的声望，接连上疏排挤他。副都御史詹仰庇极力谋取吏部和兵部的侍郎。大臣尚且如此，拿什么来责备小臣，这是不正当的求进之害。礼部尚书沈鲤、侍郎张位、谕德吴中行、南京太仆寺卿沈思孝相继自行离职，只有南京礼部侍郎赵用贤在位，词臣黄洪宪一帮人每每背后讲他的坏话，言官唐尧钦、孙愈贤、蔡系周又公开地诋毁诬蔑他。不能容忍正直的人而使小人得志，这叫作倾轧排挤之害。州县官员的选拔任用过于随便，部、寺的官员不超过一月便可当上省级官长，不考察他的才干品行。而巡抚、按察使品评人物全看是否对自己有利，不是说还差得远，就是说资历太浅，一概不加升迁或降职。本意以为是爱惜人才，却不知这实在是爱惜庸才。吏治一天天地污秽，民生一天天衰竭，这叫做地方州县之害。退休大官的权力比郡守县令还大，横行乡里，无所顾忌，谁也奈何不得。像渭南知县张栋，治理品行之好，找不出第二个来，约束抑制退休居乡官员，结果被人谗言中伤没有获得升迁，这叫作乡官横行之害。这四害不除，国家就不可能得到治理。”
奏疏出来后，朝中议论称是。而疏中所抨击的全都是当朝庇护的，于是给事中李春开站出来反驳他。李春开的奏疏先交给廷议，赵南星几乎被贬。给事中王继光、史孟麟、万自约，部下姜士昌、吴正志一起帮赵南星攻击李春开，并且揭发吴时来、詹仰庇、黄洪宪诬陷忠良、阿谀奉承的情形。李春开为之丧气，而赵南星最终因病回家。再次起用，担任考功郎中。
万历二十一年(1593)，考核在京官员，跟尚书孙钅龙一起秉公执法，淘汰选择，澄清吏治。首先贬黜他亲近的都给事中王三余和孙钅龙的外甥文选员外郎吕胤昌，其他依附政府的人连大学士赵志皋的弟弟都不能幸免。政府难以承受。给事中刘道隆于是弹劾吏部建议留任被纠察的庶僚不合法。皇帝下旨，认为赵南星等人擅权培植自己的党羽，将他降官三级。不久由于李世达等上疏挽救，贬斥赵南星为平民。后来议论挽救他的人都受到谴责，孙钅龙也离开了他的职位，一时间好人几乎全走光了。详情见《孙钅龙传》。
赵南星定居乡里，名声更大，与邹元标、顾宪成号称为海内三君子。朝廷内外上疏议论推荐他的不下百十起，终于没被起用。
光宗即位，起用为太常寺卿。不久改任右通政，提拔为太常寺卿。到任后又提升为工部右侍郎。数月之后，授官左都御史，慷慨激昂地把治理国家当作自己职责。天启三年(1623)考核在京官员，因原给事中亓诗教、赵兴邦、官应震、吴亮嗣在万历朝时结党营私、扰乱朝政，建议贬黜他们。吏科都给事中魏应嘉极力不同意。赵南星著《四凶论》，终于同考功郎程正已认定四人不合做官体统，其他考核汰除情形，完全跟他做考功郎中时相同。浙江巡按张素养举荐部内的人才，包括了姚宗文、邵辅忠、刘廷元。赵南星揭发他的错误，张素养被定罪剥夺俸禄。在此之前，巡抚地方的人有提拔举荐人才的先例，赵南星已上疏制止了。而陕西高弘图、山西徐扬先，宣府、大同李思启，河东刘大受，还按旧例继续实行。赵南星一并上疏弹劾他们，巡抚地方的人这才知道畏惧法令。
不久替代张问达为吏部尚书，这个时候，人人千方百计奔走于升迁之道，贿赂公行，言官尤为横行，每逢文选郎外出，就在半道上将他拦住，替别人求官，得不到满足就说他的坏话，，或者把他赶走。选官即使公正行使权力，也无法奈何他们，尚书也只有叹息而已。赵南星一向憎恨这弊端，锐意改革，一意推行自己的想法，政府官员和太监权贵也不能对他有什么请求，各人害怕他的刚毅严肃也不敢有什么冒犯。有一位给事赀郎请求盐运司的官职，赵南星就将赀郎注籍在王府里，而将给事派往外地。知县石三畏一向贪财，巴结权贵将要调任京职，赵南星也把他安置在王府里。当时进士没有在王府做官的，赵南星却不顾惜。
魏忠贤向来推重他，曾在皇帝面前称赞他的才干。有一天，派遣内亲傅应星介绍一位中书拿着礼物来拜见他，赵南星把他赶走了。曾与魏忠贤一起坐在弘政门下，选拔通政司的参议，态度严肃地对魏忠贤说：“皇上年幼，我们这些朝廷内外的臣子应该各自努力做好事。”魏忠贤一声不吭，愤怒之情溢于言表。大学士魏广微，是赵南星的朋友魏允贞的儿子，向来以世交子弟抚养他，魏广微进入内阁，曾三次到赵南星家，都被拒之门外，又曾经感叹说：“见泉没有儿子。”见泉是魏允贞的别号。魏广微恨之入骨，与魏忠贤相勾结来陷害赵南星。
东林党势力昌盛，大批正直的人充盈朝廷。赵南星加倍寻找举荐被遗漏的东林党人，把他们安排在各个部门。高攀龙、杨涟、左光斗执掌法令；李腾芳、陈于廷辅助选举；魏大中、袁化中主管科道；郑三俊、李邦华、孙居相、饶伸、王之肕等人全部放在部里执政。而这四司的下属官员邹维琏、夏嘉遇、张光前、程国祥、刘廷谏也都受到民众的称颂。朝廷内外欣喜地期望能有所作为，而小人侧目，更想赶走赵南星。给事中傅魁以邹维琏改任吏部自己不知道为由，首先凭借汪文言发难，弹劾赵南星改变旧制，培植私党。邹维琏引咎辞职，赵南星上疏挽留他，小人更加不满。正好杨琏上疏弹劾魏忠贤，宫中太监与政府官员更加对立，势同水火。赵南星于是闭门乞求退休，皇帝不同意。
高攀龙弹劾崔呈秀，赵南星疏论让他充边。崔呈秀处境窘迫，连夜跑到魏忠贤的住处，叩头哀求，说：“赵南星、高攀龙、杨涟等人不走，我们二人将不知死在哪里啊。”魏忠贤认为的确是这样的，于是和他一起制定阴谋。恰巧山西巡抚空缺，河南布政使郭尚友想得到它。赵南星认为太常寺卿谢应祥有好名声，将他列在第一位请求皇帝批准。已经获得圣旨恩准，御史陈九畴受魏广微的指使，说谢应祥曾出知嘉善，魏大中是他的门生，魏大中以师徒关系的缘故，同文选郎夏嘉遇商量启用他，徇私舞弊理当斥责。魏大中、夏嘉遇上疏争辩，语言涉及陈九畴。陈九畴再次上疏极力诋毁，二疏一起交给部里讨论。赵南星、高攀龙确切指出谢应祥是因为在群众有声望而被推荐的，魏大中、夏嘉遇没有私情，陈九畴的胡说不能相信。魏忠贤大怒，假传圣旨废黜魏大中、夏嘉遇，连同陈九畴一同被废黜，而斥责赵南星等人相互勾结、结党营私。赵南星立即引咎辞职，魏忠贤再次假传圣旨痛切责备他，放赵南星回家。第二天，高攀龙也引咎辞职。给事中沈惟炳上疏挽救，也被流放在外。不久因为会同推举官员违背魏忠贤的意思，同时排斥陈于廷、杨涟、左光斗、袁化中，把赵南星摈弃了的徐兆魁、乔应甲、王绍徽等人安排在政府要害部门，小人竞相升迁，国家大权都被魏忠贤夺去了。
魏忠贤及其党徒非常憎恨赵南星。每当假传皇帝下诏、告示时，总是把他看作罪魁祸首。于是御史张讷弹劾赵南星十大罪状，并且弹劾邹维涟、程国祥、夏嘉遇以及王允成。得皇帝旨，将他们全部削籍为平民。叫人再次上奏赵南星的同伙，张讷又列上李邦华及孙鼎相十四人的名字，统统将他贬职废黜了。自此被赵南星摈弃的人，没有不被提拔任用的。他向来所推重奖赏的人，全都遭到了意想不到的灾祸。那些希望迅速谋求进身为官的人，一旦攻击赵南星，便随心所欲，为所欲为。石三畏也被起用任命为御史，上疏攻击赵南星以及李三才、顾宪成、孙丕扬、王图等十五人。已经死亡的都剥夺官职，有官职的祸害更加惨烈。不久因为汪文言的供词涉及到赵南星，交给抚按审讯。正好郭尚友巡抚保定，而巡抚马逢皋也怀恨赵南星，于是相邀在朝廷上侮辱他，用竹板打他的儿子赵清衡和外孙王钟庞，将他们下狱，让赵南星赔偿赃款一万五千两银子。赵南星家一向贫穷，靠亲友捐助才将官司了结。最后将赵南星发配代州，赵清衡流放庄浪，王钟庞谪戍永昌。嫡母冯氏，生母李氏，都由于哀痛过度而死。七岁的儿子也由于受惊吓死去了。赵南星到达发配地，安然自处。
庄烈皇帝登基，下诏赦免让他返京。巡抚牟志夔，是魏忠贤的死党，故意推迟派送，赵南星最终死在发配的地方。崇祯初年，赠太子太保，谥号“忠毅”。傅槐、崔呈秀、魏广微、陈九畴、徐兆魁、乔应甲、王绍徽、张讷、石三畏、郭尚友、牟志夔，都与“逆案”相牵连，为世人所憎恶。