顾佐，字礼卿，太康人。建文二年(1400)，中进士。被授予庄浪知县。端午之日，守将集合官僚校尉，因顾佐是文士，便故意为难他。顾佐拿起弓箭一发中的，守将大服。
永乐初年，他入京任御史。七年(1409)，成祖在北京，命吏部选有才华的御史赴行在所，顾佐被选上了。他奉命招抚庆远府蛮人，到四川总督采运木材，随从北征，巡视关隘。升为江西按察副使，又被召回任应天府尹。他刚直不挠，吏民敬畏而服从，把他比作包孝肃。定都北京后，他改任顺天府尹。权贵人物觉得他在任不方便，命他出任贵州按察使。洪熙元年(1425)，他被召回任通政使。
宣德三年(1428)，都御史刘观因贪污被撤职，大学士杨士奇、杨荣推荐顾佐，说他公正廉洁而有威望，所任过的官都有风采，任京尹时，政治清明，弊病尽革。皇上很高兴，立即升他为右都御史，并赐给敕书奖励劝勉，命他考察各个御史，有不称职的将其撤职，如果御史出缺，他可保举人员送吏部补选。顾佐刚上任，即上奏废黜了严日岂、杨居正等二十人，把他们贬到辽东各卫为吏，还有八人被降职，三人被罢免；然后他推举可以担任御史的进士邓荣、国子生程富、在京候选的知县孔文英、教官方瑞等四十余人。皇上让他们先干三个月然后再任用他们。杨居正等六人上书辩诉。皇上大怒，将那些被贬为吏的人一并发去戍边。后来严日岂从戍守之地偷偷跑回京师，以别的贿赂相威胁，被顾佐上奏揭发，并说严日岂图谋陷害他。诏令将严日岂押到市场诛杀。皇上北巡时，命顾佐偕同尚书张本等人留守。皇上回来后又赐给他敕书，令他约束各个御史。于是他纠察罢黜贪婪骄纵之徒，朝纲肃然。
过了一年多，奸吏上奏顾佐接受隶役金钱，私自将其遣送回去。皇上偷偷把这奏章命给杨士奇看，说：“你不是曾经保举顾佐廉洁吗？”杨士奇说“：中朝官俸禄微薄，童仆马匹薪炭草料，都由隶役供给，所以送一半隶役，让他们出资免役，这样隶役得以回去耕作，官家得资费。中朝官都这么做，臣也是。先帝知道这一点，所以增加了中朝官俸禄。”皇上叹道“：朝臣竟这么贫穷。”便怒叱投诉的人说“：我正任用顾佐，小人敢诬陷他，一定要交给法司治罪。”杨士奇说“：小事不足以让皇上动怒。”皇上于是把该官吏的奏章交给顾佐，说：“你自己处治。”顾佐叩头致谢。他把那位官员召来说“：皇上命我处治你，汝改掉品行，我就宽贷你。”皇上听说后更加高兴，觉得顾佐得大体。有人告顾佐不处理冤诉。皇上说“：这一定是犯了重罪的人教他这么干。”命法司会审，果然是千户臧清，他杀死三个无罪的人，应被处死，便派人诬陷顾佐。皇上说：“不诛臧清，则顾佐的办法无法执行。”将臧清押到市场肢解。
八年(1433)秋，顾佐有病，请求归家。皇上不许，以南京右都御史熊概代理他的职事。过了一年熊概去世。顾佐病已痊愈，入宫朝见。皇上慰劳他，令他免朝贺，仍在原职办事。
正统初年，顾佐考察不称职的御史十五人，将他们或降职或罢免。邵宗九年任满，吏部已考核通过，他也在这十五人之中。邵宗上书申辩，尚书郭王进也说邵宗不应与在任者同考。皇上于是责备顾佐。而御史张鹏等人又弹劾邵宗有小过。皇上以张鹏朋比相欺，严厉斥责他和顾佐。顾佐上书求退休而去。皇上赐给敕书奖励安慰，赏给钞币五十贯，命户部免除他家的赋税徭役。十一年(1446)九月，他去世。
顾佐有孝友的品行，品德清白，性格严肃刚毅。每天早上趋朝，他在外庐稍息，在门外挂有双藤。百官经过的，都绕道避开。入内廷办公，他独处一间小夹室，不是议政不与官员们群坐。人们称他为“顾独坐”。但他持法过严，议论者认为这是个弊病。