1856年，太平军继西征战场转败为胜之后，又先后攻破了威逼天京数年之久的江北、江南大营，太平天国革命再次出现了有利的形势。可是，与此同时，太平天国领导集团的内部危机日益加深，洪秀全与杨秀清之间，杨秀清与韦昌辉、石达开之间的矛盾越来越表面化，终于在当年秋天发生了可悲的天京内讧。这是太平天国战争史上最大的转捩点。
总揽宗教、政治、军事三权于一身的杨秀清，成了太平天国领导集团之间各种矛盾的焦点。他有出色的政治和军事才能，但“自恃功高，一切专擅”，以致天王洪秀全“徒存其名”。①太平军一破江北、江南大营之后，杨秀清先则将北、翼、燕诸王立即分派离京，继则假托“天父神旨”，公然逼迫洪秀全封他为“万岁”②。洪秀全迫于杨秀清的权势，当面应允，暗中则采取措施，伺机铲除杨秀清。
当时，北王韦昌辉在江西战场，翼王石达开在湖北战场，燕王秦日纲在丹陽前线。9月1日夜，韦昌辉率三千余人从江西秘密赶回天京，随即对东王府发动突然袭击，于次日晨将杨秀清及其家属、近臣全部杀害。接着，韦昌辉又对杨秀清的部属进行了大屠杀，太平军将士和群众二万余人罹难，在天京造成了严重的恐怖。10月初（一说9月中旬），石达开从湖北赶回天京，责备韦昌辉滥杀无辜。不料韦昌辉又想加害于他，石达开便连夜逃出天京，其家属则被韦昌辉全部杀害。于是，石达开从安徽、湖北等地调集四万大军，集中于安徽芜湖、宁国府（今宣城）一带，准备回京讨韦。
韦昌辉的大规模屠杀和擅专朝政，激起了天京内外太平军将士和群众的极大愤慨。在此情况下，洪秀全下诏将韦昌辉处死，同时被杀的还有参与大屠杀的燕王秦日纲等约二百人。事后，洪秀全派人将韦昌辉等人的首级送安徽宁国府交石达开验看，并召其回京辅政。约11月底，石达开回到天京，延续两个多月的天京内讧，至此暂时告一段落。
石达开是东、西、南、北、翼五王中的仅存者，加之智勇兼备，在太平军中夙有声望，并为清军将领（包括曾国藩）所畏惮。因此，由他辅政，受到天京军民的拥护和欢迎。但是，内讧的陰云并未因此消散。洪秀全从天京大变乱中错误地汲取教训，自此之后，他只信任洪姓族人，排斥异姓。他在委托石达开辅政后不久，又加封其长兄洪仁发为安王，次兄洪仁达为福王，并让他俩与石达开同主朝政，以牵制和监视石达开，最后并有图害之意①。石达开既无法施展其才能，更害怕遭到与杨秀清相同的命运，便于1857年5月底离京出走。
石达开被迫出走，实际上是天京内讧的继续。由于天京内讧和石达开从天京及其它地区带走大量部队，太平天国的元气大伤，整个战争形势也随之急剧逆转。
在江苏战场，江南大营的击破和向荣的死去，曾使清军遭到沉重打击。但由于天京内讧，给了敌人以重整旗鼓的机会。1857年7月16日，清军攻陷句容，12月27日又攻陷镇江和瓜洲，太平军守将吴如孝逃回天京。1858年1月，清军恢复江南大营，再次围困天京。
在湖北战场，由于石达开东返天京，清军加紧围攻武昌。太平军守将韦志俊因困守已久，又不见援兵到来，加之其兄韦昌辉在天京被处决，丧失了坚守的决心，遂于1856年12月19日放弃武汉。武汉一失，鄂东各州县随之不守，太平军的湖北根据地全部丧失。
在江西战场，湘军于1857年10月26日攻陷湖口和梅家洲，被太平军分割二年多的湘军内湖与外江水师得以重新会合，这一带的长江水面又被湘军控制。1858年5月19日，九江城被新任浙江布政使李续宾所部湘军攻破。驻守该城近五年的太平军将领林启容率部进行了英勇的巷战，一万七千名将士全部牺牲。
太平天国虽然处于十分严酷的形势之下，但由于以下种种原因，没有发展到迅速崩溃的地步。
第一，当时全国仍处在革命高潮之中，北方的捻军、南方的天地会，以及西南各族人民的起义战争，正在蓬勃发展，方兴未艾，使得清王朝顾此失彼，忙于招架，客观上给了太平天国革命以很大的支援。
第二， 1856年10月，英、法等资本主义列强，为了在中国攫取包多的殖民特权，悍然挑起了第二次鸦片战争，清政府虽然实行妥协求和政策，但也不得不以很大的注意力和相当一部分兵力去对付外国侵略者，于是相对地减轻了对太平军的压力。
第三，石达开虽然离京出走，但他率军远征东南各省，吸引了一部分清军兵力，也在一定程度上减轻了清军对天京方面的压力。
第四，活跃在安徽战场的陈玉成和李秀成所部太平军，积极进击，顶住了清军沿江东下的势头。先是李秀成被围于桐城一带，势孤力单，后于1857年1月初与陈玉成在枞陽商定了破敌之策，确定对包围桐城之敌采取大包抄。1月中旬，陈玉成自宁国渡江北上，占无为、巢县，转攻庐江，然后直趋桐城。李秀成也率部出城，与陈玉成部协同，夹攻桐城外围之敌。2月24日，大败福建提督秦定三等所部清军，并乘胜于27日攻克舒城。3月初，太平军克六安，接着挥师北上，与捻军胜利会师。捻军接受太平天国的领导后，在淮河中游向清军展开积极进攻，牵制和削弱清军兵力，使陈玉成得以率军进入湖北，在鄂东地区转战经年，阻扼鄂军东犯，稳住了皖北太平军根据地。
正是这些客观条件，使太平天国得以继续坚持革命战争。